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噬菌体展示技术与抗体药物研发


2018年诺贝尔化学奖尘埃落定,授予Frances Arnold、George Smith、Gregory Winter三人。其中化学奖一半的奖金授予美国科学家Frances Arnold,奖励她的工作实现了酶的定向进化;另一半的奖金授予英国科学家Gregory Winter以及美国科学家George Smith,以奖励他们在肽类和抗体的噬菌体展示技术的巨大成就。

科学技术的发展是药物研发的动力,Smith等人发展出噬菌体展示技术,使得抗体药物的研发有了突破性进展。噬菌体展示技术已成为蕞重要的药物筛选平台之一,它不仅可以用于多肽、单抗的筛选,也可以用于其他蛋白质的筛选,其筛选的多样性也是该技术的亮点之一。

那么,什么是噬菌体展示技术呢?该技术是由Smith于1985年开发,之后Winter继续发展了该技术,他们所用的工具是基因工程改造过的噬菌体——一种可以感染细菌的病毒,作为宿主。

A.基因工程将编码多肽或蛋白文库的DNA序列插入到噬菌体的外壳蛋白基因,这样,多肽或蛋白就可以表达在噬菌体的表面;B.噬菌体转化到宿主细胞内,成熟的噬菌体从宿主中释放出来。1.用固定有靶蛋白的培养板捕捉能特异结合靶蛋白的噬菌体;2.洗去未与靶点结合的噬菌体;3 将与靶点结合的噬菌体洗脱下来进行下一轮转化;4.进行下一轮感染与转化;5.进一步放大目标噬菌体的数量。这样,循环往复,就可以得到想要的高亲和性抗体。

那么,这么做有什么好处呢?首先,并不是所有文库中表达的蛋白质表位都是有用的,这样可以筛选感兴趣的表位,以保证候选药物的活性;其次,在体外实验中,可以筛选人源与非人源靶点,这就节省了临床前试验的时间。

洗去不与靶点完全结合的表位,只留下亲和性高的表位

目前,已有多种抗体药物利用该技术成功上市,Adalimumab单抗就是其中出色的一例,成功研发的全人源重组IgG1:κ单克隆抗体,该药物近年来一直雄踞畅销药物的榜首,2017年,其销售额为184亿美元。此外,还有多个利用该技术的药物成功上市,有一批待上市的药物处于临床试验之中。下面就让我们了解这些成功上市的药物。

Adalimumab

Adalimumab是全人源重组IgG1-κ单克隆抗体,该药是抗肿瘤坏死因子TNFα药物,用于治疗类风湿性关节炎于2002年在美国上市。Adalimumab利用噬菌体展示技术的“指导选择”筛选出来的。该步骤分为两步,首先研究人员发展出了鼠源抗人类TNF抗体MAK195,但是鼠源抗体不能作为自身免疫病的药物,于是他们利用这个鼠源抗体指导分离与MAK195有相同表位的人源抗体。利用MAK195的重链与轻链在蛋白库中找到配对的人类DNA序列,之后利用噬菌体展示技术进一步筛选,得到高亲和性的抗TNF抗体。这就形成了Adalimumab单抗。

Belimumab

Belimumab是人源IgG1λ单克隆抗体。由Cambridge Antibody Technology 与 Human Genome Sciences (GlaxoSmithKline公司)联合研发,于2011年被批准上市,用于治疗系统性红斑狼疮,是用于治疗系统性狼疮的靶向药。Belimumab可以与B淋巴细胞刺激因子(BLyS)结合,阻止BLyS与B淋巴细胞结合,促进B淋巴细胞凋亡。研究人员利用单链可变片段(scFv)噬菌体展示技术筛选了1200个抗体,得到亲和力较高的Belimumab,临床前研究表明,该药可以抑制食蟹猕猴的B淋巴细胞生长。临床试验表明,Belimumab可以有效改善患者病情。

Ranibizumab (Lucentis?)

Ranibizumab由Genentech公司研发,是与VEGF-A结合并抑制其活性的抗原结合片段(Fab)。鼠源性抗体A4.6.1在小鼠肿瘤模型中有很好的应用,并且得到了抗肿瘤药Bevacizumab (Avastin?),Ranibizumab也是A4.6.1的突变位点的候选化合物。Clone Y0317(也就是Ranibizumab)对VEGF-A的亲和力为0.1nM,仅含有6个与亲本不同的突变,且将对VEGF的亲和力提高了100多倍,大大减少了用药剂量。该药于2006年被批准上市,用于治疗年龄相关性黄斑病变,2010年被批准用于治疗糖尿病性黄斑水肿,2015年被批准用于治疗糖尿病性视网膜病变。

Ecallantide (Kalbitor?)

Ecanllantide是由60个氨基酸组成,是一种重组激肽释放酶蛋白抑制剂。使用人类脂蛋白相关凝血抑制剂(LACI-D1)的第一个Kunitz结构域构建的噬菌体展示文库作为支架发现了Ecallantide。该药于2009年批准上市,用于治疗遗传性血管性水肿(HAE)这种罕见的遗传性疾病。

Romiplostim (Nplate?)

Romiplostim含有两个相同的亚单位,每个亚单位分别由一个IgG1 Fc结构区和c-Mpl结合区共价结合构成,结合促血小板生成受体(TPOR),于2008年由美国FDA批准上市,该药物是由FDA批准的肽体药物,也是仅有的血小板生成药物。

Raxibacumab (Abthrax?)

Raxibacumab是一种人源单克隆IgG1λ抗体,用于治疗和预防由炭疽杆菌感染造成的疾病,Raxibacumab结合炭疽杆菌的保护性抗原,阻止细菌毒素的释放。该药由Human Genome Sciences研发,试验证明,Raxibacumab明显增加了兔子与猴的生存期。

Necitumumab (Portrazza?)

Necitumumab由ImClone Systems、Eli Lilly与Bristol-Myers Squibb三公司利用“de Haard”Dyax Fab噬菌体展示技术文库,共同合作研发,该药靶向表皮生长因子受体(EGFR)。在该药的研发过程中,表皮样癌细胞作为抗体筛选的靶点,Necitumumab对该细胞的亲和性为3.3±0.5nM。2015年,Necitumumab被批准上市,与gemcitabine与cisplatin联用治疗鳞状非小细胞肺癌。

Ramucirumab (Cyramza?)

Ramucirumab也是从deHaard Fab噬菌体展示技术文库中筛选得到的,VEGFR2药物,Ramucirumab是利用人类Fabs非免疫的噬菌体展示技术文库,通过PCR扩增得到的人源重链与轻链。在临床前研究中,该药显示出优良的抗肿瘤活性,在临床III试验中显示,该药对多种肿瘤具有显着的抑制效果。2014年由美国FDA批准上市,用于治疗晚期胃癌或胃食管结合部腺癌。

总结

除了上述的上市药物,还有更多的药物处于正在临床试验中。在抗体药与蛋白质药物筛选方面,噬菌体展示技术显示出巨大的优越性,提高了药物研发的成功率,也节省了药物筛选的时间与费用。(生物谷)

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